增加羧肽酶B（CpB）处理步骤，实现强化细胞培养工艺的产量提升和电荷异构体调节
来自美国百时美施贵宝（BMS）公司的研究人员在2021年2月的《Biotechnology & Bioengineering》杂志上发表了题为“Productivity improvement and charge variant modulation for intensified cell culture processes by adding a carboxypeptidase B (CpB) treatment step”的文章。文中，研究人员指出，细胞培养工艺强化的目标是在保持可接受的质量属性的同时，提高生产率，为此，其研究开发了4种单克隆抗体（mAb）生产工艺，包括传统的生产工艺A、通过富集N-1种子而实现强化的工艺B、结合N-1种子灌流的强化工艺C以及灌流生产工艺D。后三种强化工艺都可以显著提高生产率，但对于研究中的mAb，会出现电荷异构体特性不符合预期规格的问题，即主峰水平较低，其原因由于C端赖氨酸含量较高而导致的碱性异构体水平升高所致。为了解决这一产品质量问题，研究开发了一种酶处理方法，通过引入羧肽酶B(CpB) 剪切C端赖氨酸，从而使主峰显著提高，同时使产品质量更加均一。此外，增加CpB处理的工艺B和C延长了生物反应器的时间至14天，滴度分别提高了38%和108%。这种简单而有效的酶处理策略可以适用于其它有类似产品质量问题的工艺。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
简介
哺乳动物细胞培养可分为4个阶段，即滞后期、对数生长期、稳定期和衰退期。蛋白质生产主要发生在生长后期，在稳定期达到最大，在衰退期下降。通过提高活细胞密度 (VCD)，优化细胞特异性产率，延长细胞培养处于稳定期的时间而获得一个更长的生产窗口，同时缩短细胞生长阶段，可提高细胞培养滴度和单位体积产率。补料分批生产强化是指提高N-1种子生物反应器中的最终VCD，从而提高接种VCD，继而降低生产生物反应器中细胞生长所需的时间。为了降低生产成本，研究人员开发了不同的补料分批细胞培养工艺强化策略。在N- 1种子扩增步骤使用灌流培养，或在N-1种子培养步骤使用非灌流技术，如富集N-1种子培养液，都已被用来获得相比传统N-1种子培养更更高的最终N-1 VCD。之后，在以更高的细胞密度接种的补料分批生产生物反应器中，通过缩短细胞生长阶段，来提高整体的单位体积产率。此外，通过进一步的培养基开发和工艺优化，可以显著提高以更高细胞密度接种的后续补料分批生产的VCD峰值以及生产率。然而，补料分批细胞培养最终仍会进入衰退期，VCD和细胞活性下降，且由于可能对产物质量产生负面影响的有毒代谢物的累积，蛋白质产量降低。
与补料分批培养相比，使用连续或灌流培养的工艺强化可以实现更高的单位体积产量。在灌流模式中，连续补加新鲜的培养基，而含有代谢废物和蛋白质产物的培养液以相同的速率被去除；使用细胞截留装置，如交替式切向流 (ATF) 装置，细胞被截留在生物反应器中。因此，灌流细胞培养的VCD通常较补料分批培养可显著增加，细胞培养的生产时间可从1-3周延长到数月。
除了生产率，必须在工艺开发过程中获得可接受的产品质量，并在整个商业化生物生产生命周期中保持所需质量。产品质量属性包括，但不限于，工艺相关杂质 (如宿主细胞蛋白 (HCP)、DNA等) 和产物相关杂质。众所周知，单克隆抗体(mAb)的电荷异构体、聚体和糖基化特性等产物相关质量属性对整个生产过程中的各种条件变化非常敏感。因此，必须将产物质量控制和旨在缓解影响的策略设计到整个工艺当中，从细胞系工程开始，到工艺控制条件、细胞培养基组成以及培养后的操作等。
电荷异构体是具有不同净电荷性质的修饰后mAb物质，可以通过基于电荷的纯化方法进行分离，分为酸性异构体、主峰和碱性异构体。酸性和碱性异构体的不同水平可能会影响治疗效果。促成碱性异构体的蛋白质修饰包括C端赖氨酸/精氨酸、C端酰胺化、N端焦谷氨酸、琥珀酰亚胺和异构化。由于羧肽酶B(CpB)可以特异性地去除C端碱性氨基酸残基，比较CpB酶切前后的mAb图谱可以清楚地证明C端赖氨酸对碱性异构体形成的贡献。mAb重链C端赖氨酸异构体在mAb产品中较为常见。这种异构化被认为是由于内源性羧肽酶对C端赖氨酸残基的低效裂解所致。从调控的角度来看，C端赖氨酸导致的更高碱性异构体在安全性和有效性方面是最小的担忧，因为这种赖氨酸在静脉注射给患者后，在体内会被内源性血清CpB快速裂解。尽管如此，仍需要监测电荷异构体，以确保生产的一致性和产物的可比性。在大多数mAb产品的放行标准中，通常会规定构成该电荷异构体主峰的蛋白质百分比。
在本研究中，我们开发了一种简单、稳健且具有成本效益的CpB处理方法，该方法可在电荷异构体特性方面提高产品质量均一性，从而提高使用工业化CHO细胞系的强化细胞培养工艺的生产一致性以及整体的mAb生产率。该方法在多个不同的强化工艺中得到了证实，包括非灌流的N-1强化(工艺B)、灌流N-1强化 (工艺C)，以及在N阶段生产生物反应器(工艺D)使用灌流的强化。相比传统补料分批工艺（工艺A），这些工艺都获得了更高的生产率。然而，由于主峰水平低于放行规格，强化补料分批工艺B和C需要提前收获，灌流工艺D不能在生产中实际执行。较低的主峰主要是由于更高的C端赖氨酸水平导致的碱性异构体升高所致。研究通过在上游工艺过程中增加CpB处理步骤，来酶切C端赖氨酸。这一操作显著降低了碱性异构体，并充分提高了主峰水平，使所有强化工艺方案获得的产物符合放行标准。此外，对于强化的补料分批培养，增加CpB处理步骤可延长培养时间，并显著提高最终滴度。同时，研究证实，可在下游工艺过程中充分去除CpB，对下游步骤产量或任何其它工艺中质量属性没有影响。
方法和结果
细胞系、培养基、上游细胞培养滴度、产率以及工艺内质量分析、详细的CpB处理方法、下游工艺和CpB清除研究、产物质量分析、上游成本分析及结果的详细介绍，请参考原文。
上游细胞培养工艺：研究使用了4种不同的细胞培养工艺，以进行mAb-1（IgG4）的生产。工艺A为传统的14天补料分批工艺，接种密度为0.3 x 10^6 cells/mL，温度在第5天从36.5调整为34℃。工艺B为强化的补料分批工艺，通过富集N-1培养液，以达到更高的N-1性能，从而以3 x 10^6 cells/mL的密度接种5 L生产生物反应器（工作体积3 L，Sartorius），在第6天，将温度从36.5调整为34℃。工艺C为结合了灌流N-1种子培养的强化补料分批工艺，以15 x 10^6 cells/mL的密度接种5 L生产生物反应器（工作体积3 L，Sartorius），在第4天，降低温度。工艺D为灌流生产工艺，以10 x 10^6 cells/mL细胞密度接种3 L生物反应器（工作体积1 L，Applikon），温度恒定为36.5℃，其从第0天开始，使用XCell ATF1进行培养基置换，并逐步提高至2-4 VVD，直到达到50 x 10^6 cells/mL的目标VCD。工艺D的批次1在第5天达到目标VCD，其培养基置换使用“Push-to-Low”（推至更低）策略，5-11天为4 VVD，11-18天为3 VVD，18-25天为2 VVD，26-31天为1 VVD。工艺D的批次2在第6天达到目标VCD，然后将培养基置换速率调节为2 VVD，并维持运行21天。
工艺B（A）、工艺C（B）和工艺D（C）中CHO细胞培养的mAb-1生产性能，实线为标准化空间产量（以工艺B第10天滴度的平均值为100%进行标准化处理），虚线为标准化空间-时间产量（基于整个培养期间的 标准化滴度进行计算）。
工艺B（A）、工艺C（B）和工艺D（C）中CpB处理（虚线）和未CpB处理（实线）的mAb-1标准化主峰水平（以放行规格的主峰水平为100%）。
CpB处理和未处理工艺的mAb-1的iCIEF图谱比较。
讨论
在本研究中，增加酶处理步骤的目的是为了提高不同强化细胞培养工艺的生产率，并优化电荷异构体特性。不进行CpB处理时，强化工艺B在10天、工艺C在6天后，不能满足主峰规格要求。CpB处理方法只需要适度的0.01% (w / w) CpB：mAb比例，并在宽泛的温度范围20-37°C以及pH范围7.2-9条件下孵育2小时。这种CpB处理方法可以有效地剪切C端赖氨酸，从而最大限度地提高主峰水平，并获得更为均质的mAb产品特性。CpB处理可增加到收获前的生产生物反应器，此时，不需要无菌操作。此外，研究证明CpB处理不会影响下游工艺。
此外，CpB是人体自然产生的一种酶。mAb产品中C 端赖氨酸的存在被认为对患者的安全性和效力没有影响，因为在其注射后不久，就会被血液中自然存在的CpB剪切。但这里的重点在于，CpB处理可使实现不同细胞培养工艺之间更好的可比性。CpB被认为可以安全地作为细胞培养的原材料。此外，建议在下游纯化步骤之前使用。
通过细胞系工程、培养基开发和生物反应器优化来延长细胞培养生产阶段的时间，是提高补料分批工艺滴度的常用策略。无论细胞培养生产持续时间如何，每个生产批次都需要相似的达到VCD峰值的细胞生长时间、相似的批次间周转时间、以及针对批次设置的相似成本，包括种子扩增、培养基制备和生物反应器操作。因此，通过延长稳定期细胞培养生产窗口来提高滴度，可以提高生产效率，降低生产成本。然而，持续2周或更长时间的补料分批细胞培养最终会进入衰退期，毒性代谢产物增加，VCD和细胞活性下降，这与产物质量恶化有关。在某些情况下，为了满足质量要求和放行规格，补料分批细胞培养可能需要在稳定期更早地收获。
这就是强化工艺B和C必须提前终止的原因，因为在第14天，对于电荷异构体物质，主峰不能满足预定的标准。然而，CpB处理后，所有强化工艺的主峰符合规格 。增加CpB处理步骤，工艺B从10天延长到了14天，单位体积产量提高了38%，每克最终药物底物的上游耗材成本降低了22%。同样，工艺C从6天延长到了14天，单位体积产量提高了108%，上游耗材成本降低了46%。与传统的工艺A相比，为工艺强化策略增加CpB处理步骤，可使工艺B、C和D的时间-空间产量分别提高3.7、5.4和11倍。
总结来说，本研究开发的CpB处理方法提供了一种简单、可靠、灵活且经济有效的C端赖氨酸去除方法，且其对mAb-1细胞培养的影响极低。由于其内在机制的性质，这种酶处理策略可以适用于其它有类似产品质量问题的工艺。
原文：J.Xu, S.Zheng, Z.Dawood, Productivity improvement and charge variant modulation for intensified cell culture processes by adding a carboxypeptidase B (CpB) treatment step. Biotechnology & Bioengineering, 2021, https://doi.org/10.1002/bit.27723.
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